Macam-Macam Kromatografi
1.
Ion
Exchanger Cromatography
Metode yang paling populer untuk pemurnian
protein dan molekul lainnya yang dikenakan adalah kromatografi pertukaran ion. Dalam kromatografi penukar kation molekul
bermuatan positif tertarik pada dukungan solid bermuatan negatif. Sebaliknya, dalam kromatografi pertukaran anion, molekul
bermuatan negatif tertarik pada dukungan solid bermuatan positif.
·
Mekanisme
Untuk mengoptimalkan mengikat semua molekul
bermuatan, fase gerak umumnya rendah konduktivitas menengah (yaitu, rendah
untuk konsentrasi garam menengah) solusi. Adsorpsi molekul untuk dukungan yang solid didorong oleh
interaksi ionik antara kelompok ionik malah dibebankan dalam molekul sampel dan
dalam ligan fungsional pada mendukung. Kekuatan
interaksi ditentukan oleh jumlah dan lokasi dari biaya pada molekul dan pada
kelompok fungsional. Dengan meningkatkan
konsentrasi garam (umumnya dengan menggunakan gradien garam linear) molekul
dengan interaksi ionik terlemah mulai terelusi dari kolom pertama. Molekul yang memiliki interaksi ionik kuat memerlukan
konsentrasi garam yang lebih tinggi dan terelusi kemudian dalam gradien.
Kapasitas pengikatan resin pertukaran ion umumnya cukup
tinggi. Ini adalah sangat penting dalam
kromatografi skala proses, tetapi tidak penting untuk pemisahan skala analitis.
·
Buffer pH
Sebagai aturan, pH
buffer fase gerak harus antara pI ( titik isoelektrik ) atau pKa ( asam disosiasi konstan ) dari molekul
bermuatan dan pKa dari kelompok dibebankan pada dukungan solid. Misalnya, dalam kromatografi penukar kation, menggunakan
kelompok fungsional pada dukungan solid dengan pKa 1,2, sampel molekul dengan
pI 8,2 dapat dijalankan dalam buffer fase gerak pH 6,0. Dalam kromatografi pertukaran anion molekul dengan pI 6,8
dapat dijalankan dalam buffer fase mobile pada pH 8,0 ketika pKa dari dukungan
yang solid adalah 10.3 (www.separations.us.tosohbioscience.com).
2.
Hidrophobic Interaction
Chromatography
Pemisahan menggunakan HIC didasarkan pada
interaksi reversibel antara protein dan ligan hidrofobik terikat pada matriks
kromatografi. Asam amino
hidrofobik protein dan peptida biasanya terletak jauh dari permukaan molekul.
Namun, banyak biomolekul memiliki beberapa kelompok
hidrofobik yang cukup terkena memungkinkan interaksi dengan ligan hidrofobik
pada media. Dibandingkan dengan kromatografi
fase terbalik, kepadatan ligan pada matriks jauh lebih rendah dan memungkinkan
kondisi elusi ringan, membantu untuk melestarikan aktivitas biologis. HIC sangat cocok untuk sampel diendapkan dengan amonium
sulfat atau dielusi dalam konsentrasi garam yang tinggi karena tinggi buffer
kekuatan ion meningkatkan interaksi hidrofobik.
Interaksi
ditingkatkan oleh buffer dengan kekuatan ion yang tinggi, yang membuat HIC
langkah pemurnian baik setelah pengendapan amonium sulfat atau setelah elusi
garam tinggi selama kromatografi penukar ion (IEX). HIC sangat cocok untuk menangkap atau
langkah-langkah perantara dalam skema pemurnian.
Selama HIC, komponen
sampel mengikat kolom di tinggi penyangga kekuatan ion, biasanya 1 sampai 2 M
amonium sulfat atau 3 M NaCl. Konsentrasi tinggi garam, terutama amonium sulfat, dapat
memicu protein. Oleh karena itu, periksa
kelarutan protein target dalam kondisi yang mengikat untuk digunakan. Elusi biasanya dilakukan dengan menurunkan konsentrasi garam,
bertahap atau menggunakan gradien.
Protein dalam
larutan air memiliki berbagai residu permukaan terkena pelarut untuk derajat
yang berbeda, tergantung pada struktur protein. Residu ini dapat hidrofilik, misalnya mereka dapat membawa
muatan, atau mereka dapat hidrofobik, seperti dalam alanin asam amino fenil,
tyrosine dan tryptophan. Kelompok hidrofobik
akan lebih memilih untuk mengubur diri secara internal dalam struktur 3D
protein tetapi beberapa akan terkena. Garam
dapat digunakan untuk mengendapkan protein atau mengkristal keluar dari solusi
- menyebabkan protein untuk diri-asosiasi. Para
ilmuwan telah menyadari, sejak Hofmeister, bahwa garam yang berbeda memainkan
peran penting dalam diri-asosiasi atau asosiasi dengan permukaan hidrofobik.
Fenomena ini
membentuk dasar untuk kromatografi interaksi hidrofobik (HIC). Sebuah matriks kromatografi mengandung
gugus hidrofobik, mengikat protein dari larutan air untuk luasan yang berbeda,
tergantung pada struktur protein dan berbagai faktor dikontrol termasuk
konsentrasi garam, pH, suhu dan pelarut organik seperti yang diilustrasikan
pada gambar di bawah ini.
HIC sesuai dengan semua tahapan proses pemurnian. Contoh aplikasi termasuk menangkap hasil
tinggi, polishing antibodi monoklonal, menghilangkan spesies terpotong dari
bentuk full-length, memisahkan aktif dari bentuk tidak aktif, dan pembersihan
virus.
Sebuah ilustrasi elusi 4 protein dengan model
struktur 3D yang berbeda mereka dari kolom HIC, menggunakan turun gradien
konsentrasi garam. Warna
kuning menunjukkan residu hidrofobik.
Alur kerja yang disukai tergantung pada
aplikasi; terutama,
apakah pemurnian akan ditingkatkan dalam proses industri. Untuk banyak aplikasi dalam penelitian, pemilihan media
ditentukan hanya dengan kemurnian diperlukan. Pilihan
sukses menengah tergantung pada menemukan orang yang tepat mengikat
selektivitas dengan recovery produk yang baik, sedangkan kebutuhan untuk metode
optimasi dan karakterisasi umumnya kurang dari untuk sebuah proses yang akan
ditingkatkan dan digunakan untuk produksi industri biasa. Alur kerja dimulai dengan cara yang sama untuk kedua jenis
aplikasi, seperti yang diilustrasikan pada gambar di bawah.
Workflow untuk pemilihan HIC menengah dan studi lebih lanjut kondisi
mengikat dan elusi.
GE Healthcare memperkenalkan media pertama
HIC komersial pada tahun 1977 dan sekarang menawarkan salah satu rentang
terluas media HIC di pasar, yang meliputi laboratorium yang paling umum dan
aplikasi industri. Selain
berbagai produk HIC, interaksi hidrofobik sering memainkan peran dalam
penggunaan media kromatografi multimodal. Media
ini sering digambarkan sebagai penukar ion garam-toleran, atau penukar ion menawarkan
selektivitas yang unik. GE Healthcare menawarkan
Capto MMC dan Capto mematuhi di kelas ini.
Keluarga Media Bioproses kami dikembangkan
dan didukung untuk pembuatan skala besar biopharmaceuticals. Dukungan ini termasuk metode divalidasi
manufaktur, memasok media jangka panjang aman, penanganan yang aman dan mudah,
dan Dukungan Regulasi Files (RSF) untuk membantu proses validasi dan pengiriman
ke pihak berwenang. Selain itu, Cepat Trak
Training & Education menyediakan tingkat tinggi, pelatihan hands-on untuk
semua aspek kunci dari pengembangan bioproses dan manufaktur.
·
Menangkap ke Polishing
Untuk mencapai potensi pemisahan penuh HIC
dalam berbagai aplikasi menuntut berbagai media dengan hydrophobicities berbeda
dan sifat operasional. Hal
ini dicapai dengan memvariasikan matriks dasar dan sifat kimia dari ligan.
Khusus untuk proses hilir industri, ukuran manik yang
berbeda dapat dituntut oleh aplikasi, khususnya untuk menangkap atau polishing.
Manik-ukuran pilihan menganggap kedua
kekuatan menyelesaikan yang diperlukan dan penurunan tekanan atas tempat tidur
- dipengaruhi oleh viskositas sampel dan sering dibatasi oleh spesifikasi
peralatan dalam aplikasi skala besar. Akhirnya, kisaran meliputi media yang dengan struktur
manik-manik yang lebih terbuka cocok untuk protein yang sangat besar, seperti
Octyl Sepharose 4 Fast Flow dan Butyl Sepharose 4 Fast Flow. Angka ini menunjukkan hasil dari penelitian yang didasarkan
pada 100 percobaan di mana enam protein model dengan ukuran berbeda, hidrofobik
dan biaya dielusi dalam sama ammonium sulfat gradien.
Hidrofobisitas peta media HIC. Berdasarkan studi elusi dari
enam protein Model: ovalbumin, a-chymotrypsinogen, ribonuklease, laktoferin,
lisozim, a-amilase.
·
Pilih Media Tepat
Pemurnian protein dapat dibagi menjadi
capture, pemurnian intermediate dan polishing, tergantung pada tujuan dan sifat
tantangan. HIC dapat digunakan pada setiap tahap ini dan media Capto menawarkan
berbagai kondisi operasi. Memilih media yang tepat sangat tergantung pada
mendapatkan selektivitas mengikat tepat.
- Secara
umum, menggunakan media Capto untuk produktivitas optimal dalam menangkap
atau langkah-langkah perantara. Rata-rata ukuran manik 75 m
- Gunakan
media yang Sepharose Fast Flow untuk menangkap pada arus hingga 300 cm /
jam dan ketika Media Capto tidak menawarkan selektivitas mengikat
diperlukan. Rata-rata ukuran bead 90 pM.
- Akhirnya,
tantangan yang berkaitan dengan polishing mungkin memerlukan manik-manik
kecil untuk mencapai resolusi tinggi, seperti yang ditawarkan oleh media
yang Sepharose High Performance. Rata-rata manik ukuran 34 m.
3.
Size Exclusion Chromatography
Pemisahan berbagai konstituen dengan meninjau perbedaan
ukuran dan geometri molekul adalah dasar kromatografi eksklusi. Perbedaan
ukuran menyebabkan beberapa partikel bergerak lebih cepat dari
yang lainnya sehingga menimbulkan
perbedaan permukaan migrasi. Kromatografi
eksklusi dapat dikelompokkan dalam tiga kategori :
a.
Kromatografi permeasi gel atau filtrasi gel
Filtrasi
gel adalah suatu
teknik yang menguraikan
campuran zat-zat sesuai
dengan ukuran molekulnya. Teknik
ini didasarkan atas inklusi
dan eksklusi suatu
zat terlarut melalui suatu
fase diam yang
terbuat dari gel
polimer yang berikat
silang dan berpori heterogen. Dalam kromatografi elusi
cair-padat, pemisahan terjadi antara fase cair di dalam partikel gel dan cairan
di luar yang mengelilingi partikel gel. Akibat mekanisme perbedaan laju permeasi
masing-masing molekul zat terlarut dari
dan ke interior
partikel gel, pemisahan akan
terjadi. Dengan aliran cairan, molekul akan berdifusi ke seluruh bagian gel, hanya molekul
yang mempunyai ukuran
besar yang tidak dapat
masuk ke daerah
yang merupakan rongga-rongga gel.
Akibatnya molekul dapat lewat dengan
tanpa rintangan sepanjang kolom
melalui interstisi volume
cairan, sedangkan molekul
kecil akan terpenetrasi
secara dalam pada
celah-celah gel. Sudah
tentu molekul-molekul besar
akan terelusi lebih dahulu
baru kemudian diikuti
oleh molekul -molekul lebih
kecil yang diperosokkan dulu
ke dalam rongga-rongga
gel. Pemisahkan ini
dimungkinkan akibat penahanan
ukuran yang terjadi dalam partikel gel (Khopkar, 1990).
Pemisahan suatu tipe gel tertentu sangat tergantung
pada ukuran molekul dan sifatsifat kimia dari zat yang akan dipisahkan.
Misalnya pada biogel 0-10 digunakan untuk zatzat yang
mempunyai berat molekul
yang berkisar antara
5000-17000 satuan. Molekul dengan berat molekul di atas $batas
ini yaitu limit eksklusi, akan lewat saja tanpa rintangan dari gel. Di bawah
limit eksklusi, zat tersebut akan terelusi pada volume elusi yang sesuai dengan
volume bed total. Untuk bekerja dalam medium
yang tidak berair, gel yang tepat
digunakan adalah Sephadex LH-20 (Khopkar, 1990).
b.
Eksklusi dan retardasi ion
Eksklusi Ion adalah
suatu proses untuk
memisahkan materi ionik
dari materi nonionik didasari
pada perbedaan distribusi kedua tipe zat pelarut ini di antara fase resin penukar
ion dan larutan air. Suatu resin penukar ion tidaklah sama dengan absorbsi
biasa. Dengan mengatur jaringan
muatan suatu resin,
dapat diperoleh suatu
keadaan di mana hanya satu macam ion elektrolit yang dieksklusikan.
Jumlah total elektrolit yang berdifusi ke
dalam resin dibatasi
oleh prinsip elektronetralitas. Makin kuat terionisasi
suatu resin penukar makin efisien
untuk eksklusi ion. Banyaknya garam yang berdifusi ke dalam resin berkurang
dengan bertambahnya kapasitasnya penukar ion suatu resin. Sebagian besar ion elektrolit
berberat molekul rendah yang
mudah larut dalam air, bebas
berdifusi ke dalam dan ke luar
resin tidak peduli
dengan besarnya kapasitas
resin, sehingga cenderung berkonsentrasi sama
pada kedua fase
pada saat kesetimbangan
tercapai. Selama ada perbedaan koefisien distribusi untuk
berbagai zat terlarut, maka pemisahan mungkin akan terjadi (Khopkar, 1990).
Retardasi ion
adalah suatu metode
pemisahan dengan kolom
yang sangat mirip dengan eksklusi ion tetapi menggunakan
suatu resin penukar ion yang terdiri dari gugusan fungsi kation
maupun anion dalam matriks resin. Resin akan mengadsorbsi kation-kation dan anion-anion
dari larutan sampel. Afinitas absorbsi tersebut rendah sehingga air dapat digunakan untuk
meregenerasi resin. Jadi
perbedaannya dengan eksklusi
ion adalah pada retardasi ion-ion juga dihambat lajunya
selama mengalir sepanjang kolom, serta retardasi ion dapat
digunakan untuk pemisahan
elektrolit dari nonelektrolit
yang berukuran besar, dan
juga elektrolit dari
elektrolit lain jika
tetapan distribusinya cukup
berbeda, misalkan NH4OH + NaOH;
NH4Cl + ZnCl2; FeSO4 + ZnSO4 dapat dipisahkan dengan mudah dengan proses
retardasi ion (Khopkar, 1990).
c.
Molecular Sieve Anorganic – Zeolit
Zeolit alam dan sintesis membentuk suatu saringan
molekul untuk pemisahan gas-gas dan
molekul organik berukuran
kecil. Volume suatu
zeolit terbentuk dari
suatu rongga rongga yang
saling dihubungkan oleh
saluran saluran (channels). Penyaringan
dan aksi penghambatan dari
saluran dikombinasikan dengan
aktivitas adsorpsi permukaan
matriks kristal sehingga memungkinkan digunakannya zeolit untuk
memisahkan molekul-molekul yang
lebih kecil dari
ukuran saluran ini
dari molekul yang
lebih besar ukurannya
dari saluran. Aktivitas permukaan
dan geometris molekular
berperan dalam pemisahan
ini (Khopkar, 1990).
Secara struktural
zeolit adalah rangka tetrahedral
yang bersatu membentuk
struktur sarang tawon dengan
rongga-rongga besar yang
saling berhubungan melalui
saluransaluran kecil. Penampang lintang dari saluran inilah yang
menentukan ukuran molekul yang dapat
masuk ke dalam
rongga-rongga. Ukuran dari
posisi ion logam
(misalkan Na, Ca) dalam
kristal zeolit, dan
tipe struktur jaringan rangka
tetrahedral alumina silikat
zeolit menentukan diameter efektif dari saluran-saluran tersebut
(Khopkar, 1990).
Terdapat
bermacam tipe zeolit,
misalkan tipe molekular sieve 4Å adalah [Na12(AlO2)12(SiO2)12]. Molekul
berdiameter lebih kecil
dari 4Å j=ajab
teradsorbsi, misalkan H2O, CO2,
H2S, SO2 dan hidrokarbon
dengan 1-2 atom
karbon. Etana dapat masuk
dalam molekular sieve
5Å, yang dibuat
dari molekular sieve
4Å dengan menggantikan Na oleh Ca
dan K. Parafin rantai lurus dapat masuk ke dalamnya, demikian juga alkohol
sampai dengan C4, tetapi siklopropana tidak dapat masuk, demikian juga asam naftanik
dan molekul aromatik lainnya. Tipe 10 dan 13 adalah [Na8(AlO2)80(SiO2)106]. Senyawa
ini mengadsorbsi molekul berdiameter sampai 10Å (Khopkar, 1990).
Molekular sieve mempunyai afinitas
yang lebih besar terhadap
molekul polar dan senyawa
yang terpolarisasi karena induksi pada molekul non polar yang berukuran
sama. Molekul-molekul polar tertahan
dengan kuat dalam
rongga kristal. Pada
pemurnian dan industri gas,
molekul sieve digunakan untuk menghilangkan molekul-molekul tidak jenuh (polar). Zeolit
diguankan juga sebagai
medium berlangsungnya reaksi.
Bahan kimia di dalamnya
sebagai hasil reaksi
dapat dikeluarkan dengan
teknik vakum atau
dengan penggeseran menggunakan materi yang teradsorbsi kuat, misalkan
air. Molekular sieve ini
dapat diaktifkan
kembali dengan pemanasan
200-350o
C. Mereka
juga digunakan dalam
kromatografi
gas padat sebagai fase diamnya dalam kolom (Khopkar, 1990).
Schematic of molecular
sieve membrane for separating hydrogen from mixed gas streams.
II. KOLOM
Kolom eksklusi mengandung partikel berpori dengan
garis tengah pori yang berbeda. Solutyang disuntikkan ke dalam kolom akan
berdifusi ke dalam pori yang garis tengahnya lebih besar daripada garis tengah
efektif solut. Garis tengah efektif ditunjukkan pada gambar berikut :
(Khopkar, 1990).
Perhatikan, walaupun bobot molekul sama, garis tengah efektifnya
berbeda, dan komponen yang garis
tengah efektifnya paling
besar terelusi lebih
dahulu. Selain itu, garis
tengah efektif mencakup pula
molekul solvasi apa saja (Khopkar, 1990).
Dengan bertambah besarnya garis tengah efektif solut,
jumlah pori yang dapat dimasukinya dan kemampuannya berdifusi ke dalam pori
menurun. Jadi, jika solut bergaris tengah demikian rupa sehingga
tidak dapat berdifusi
ke dalam pori
yang mana pun,
maka solut tersebut dapat dikatakan
dieksklusi sempurna dan tidak ditahan, artinya solut itu terelusi dalam volum
mati (Vo) kolom. Solut yang
mampu berdifusi sempurna
ke dalam semua
pori dikatakan berpermerasi sempurna ke dalam
kemasan. Solut jenis ini memerlukan
volum pelarut yang
jauh lebih besar untuk mengelusinya dari kolom. Pemisahan
komponen dapat tercapai jika komponen itu terelusi dengan volum tambat antara Vo
dan volum permeasi total (Khopkar, 1990).
Volum kolom eksklusi terdiri atas tiga komponen yang
jelas, yaitu :
1. volum mati, Vo – volum
ruang antarpartikel yang ditepati fase gerak yang mengalir,
2.
volum yang ditempati oleh bagian padat kemasan,
3. volum pori (Vp) – volum yang
ditempati fase gerak yang mandek. Pada kromatografi eksklusi, ini dapat
disamakan dengan volum fase diam (Khopkar, 1990).
Kita dapat mendefinisikan koefisien
distribusi K solut sebagai nisbah
volum pori yang dapat dimasuki solut (Va) dan volum pori
total (Vp), yaitu:
K=Maka
volum tambat (Vr) solut dinyatakan dengan persamaan berikut : Vr = Vo + KVp Rentang
K antara 0 sampai 1, karena jika solut dieksklusikan seluruhnya, maka K= 0, dan
jika solut berpermerasi ke pori seluruhnya, maka K=1 (artinya, V a = Vp jika
kolom berperilaku secara eksklusi ’ideal’ (Khopkar, 1990).
Maka
jelaslah bahwa untuk
memperoleh pemisahan semaksimum
mungkin kita menginginkan volum
mati yang kecil dan volum pori yang besar. Harus diingat pula bahwa untuk sistem tertentu,
volum yang diperlukan
untuk mengelusi semua
komponen cuplikan besarnya tertentu (artinya Vo dan V p ). Jadi,harus
dilakukan segala usaha untuk meminimumkan pelebaran pita (Khopkar, 1990).
Memilih ukuran pori kemasan umumnya bergantung pada
ukuran molekul solut yang akan dipisahkan. Sering cuplikan ukurannya sangat
beragam (artinya bobot molekul sangat berbedabeda) dan kemasan dengan satu
ukuran pori saja tidak memadai untuk memisahkan semua jenis molekul. Beberapa
mungkin dieksklusi seluruhnya
dari pori (K=0)
dan terelusi sabagai
satu puncak dengan volum
mati (Vo), sedangkan
yang lain berpermeasi
ke semua pori (K=1)
dan terelusi sebagai satu
puncak dengan volum
permeasi total (Vo+Vp).
Yang lainnya lagi berpermeasi ke pori secara selektif,
bergantung pada ukuran nisbinya, dan terelusi dengan volum tambat Vr yang
dinyatakan oleh persamaan Vr = Vo + KVp ini ditunjukkan berupa bagan dalam
gambar
:
DETEKTOR
Dalam SEC, konsentrasi
dari berat polimer
dalam eluen mungkin
dapat dipantau terusmenerus
dengan sebuah detektor.
Ada banyak macam
detektor yang tersedia
dan dapat dibagi menjadi dua
kategori. Yang pertama
adalah konsentrasi detektor
sensitif meliputi serapan
UV, indeks refraktometer diferensial (DRI) atau indeks bias (RI)
detektor, inframerah (IR) penyerapan dan kepadatan detektor. BM-sensitif
detektor termasuk detektor cahaya hamburan sudut rendah (LALLS), multi-sudut
hamburan cahaya (MALL). Kromatogram yang dihasilkan oleh distribusi berat
polimer sebagai fungsi volume retensi (Trathnigg, 1995). Detektor yang
paling sensitif adalah
diferensial fotometer UV dan detektor
yang paling umum adalah
refraktometer diferensial
(DRI). Ketika karakterisasi
kopolimer, perlu untuk memiliki dua detektor dalam rangkaian.
Untuk penentuan komposisi akurat kopolimer setidaknya dua dari
detektor tersebut harus detektor konsentrasi (Sandler, 1998).
Penentuan
komposisi kopolimer yang
paling dilakukan dengan
menggunakan detektor UV
dan RI, meskipun kombinasi lain dapat digunakan
(Pasch, 2000).
1.
Refraktor diferensial
Detektor
indeks bias dibangun
sebagai aliran melalui refraktometer diferensial yang
terus menerus mengukur perbedaan indeks bias
eluat dan eluen
murni. menunjukkan skema jalur
sinar melalui instrumen. Cahaya
yang dipancarkan dari 1
melewati celah LED 2 sebelum dibelokkan
oleh cermin semi-transparan 3 dan melintasi dua
bagian dari sel,
mengukur 4 cermin
semitransparan 3, dan sejajar bidang pelat kaca 6. Akhirnya, sinar dibagi menjadi
dua parsial balok
oleh prisma 7. Intensitas dari balok di 8a, 8b yang
menggunakan foto dioda dan digunakan sebagai ukuran untuk posisi sinar asli.
(Limanto,
2011).
DAFTAR
PUSTAKA
Limanto,
Kenny R., Bernadetta Arum W., Rachelia Octavia, Jenny Marina, Ina Juni A.,
Kristina Nety. 2011. Size Exclusion
Chromatography. Yogyakarta : Universitas Sanata Dharma.
Khopkar, S.M..1990. Konsep
Dasar Kimia Analitik. Jakarta:
UI Press.
0 komentar:
Posting Komentar